硅珠法
CTAB—硅珠法提取DNA实验流程
前言:
实验是要求非常严谨的过程,每个一步骤都可能对后面的操作产生很大影响,乃至影响后面的结果.一步错,步步错,每一个操作的失误都可能导致整个实验的失败.
事实求是与踏踏实实的作风是每个做实验的人必备的基本品质.永远记住,任何弄虚作假的行为都是可耻的.
在这个充满学术腐败的科学界,保持自己的纯真.
谨记
1.材料的采集
采取植物的嫩叶,可以用硅胶干燥保存,也可以用冰袋,主要是防止叶片组织的降解及叶片的褐化.用泡沫塑料箱子带回,置于-70℃冰箱保存.
2.CTAB—硅珠法提取DNA实验流程
各加入液体的配制：
1、CTAB提取液：
2%（W/V g/mol ）CTAB；
5%（W/V g/mol）PVP；
1.4mol/lNaCl；
20mmol/L EDTA PH=8.0；
l00mmol/l Tris-HCl PH=8.0；
2%(V/V)巯基乙醇(临时加入)
配制量：500ml
配制方法：
(1)计算所需组分量
CTAB 10g 需热磁力搅拌
PVP 25g
NaCl 40.908g
EDTA.Na2.2H2O 3.7224g 调PH=8 冷却为常温时(母液)
Tris 6.057g
(2)称取CTAB 10 g， NaCl 40.908g， PVP 25g置于500ml烧杯中
(3)加入约300dd H2O(双蒸水)充分磁力搅拌溶解
(注意：EDTA和PVP较难溶，加热溶解的同时用热磁力搅拌直至完全的透明为止)
(4)量取20mlEDTA(0.5mol/l PH=8 )， 50ml Tris-HCl(1 mol/l PH=8)溶液于烧杯中，均匀混合
(5)将烧杯溶液定容至500ml后，高温高压灭菌
(6)室温保存。
0.5mol/LEDTA 配制
组分浓度： 0.5mol/l EDTA， PH=8
配制量：500ml
配制方法(1)称取93.06克EDTA.Na2.2H2O，置于500 ml烧杯中
(2)加入约400ml dd H2O.用热磁力搅拌器充分搅拌
(3)用NaOH调节PH值到8，约用10克固体NaOH
(4)在溶液冷却后，再用NaOH调节至PH=8
(5)加dd H2O将溶液定容到500 ml
(6)高温高压灭菌后，室温保存
NaOH溶液的配制
组分浓度：5 mol/l NaOH
配制量：100 ml
配制方法(1)称取固体NaOH20克于容器中
(2)加入dd H2O定容到100 ml
100 mmol/l Tris-HCl的配制
组分浓度： mmol/l Tris-HCl， PH=6.4
配制量：250 ml
配制方法(1)称取3.025克Tris于250 ml烧杯中.
(2)加入约200ml dd H2O充分搅拌溶解.
(3)用浓盐酸调节PH值到6.4.所用浓盐酸约3 ml
(4)将溶液定容至250ml
(5)用棕色瓶分装于4度冰箱中
(6)如使用，用水浴加热溶解.
2、氯仿-异戊醇的配制：
配制方法(1)简单的体积混合，既要求比例为24：1即可
(2)储存于棕色玻璃瓶子中
(3)置于4度冰箱以便日后使用
3总的实验流程
3.1．总的DNA的提取：
1. 在10ml离心管（eppendorf管）中加入4mlCTAB提取液及80ul巯基乙醇，在65℃水浴锅中预热
2. 取材料1-2g于研钵中，加入适量液氮迅速多次研磨成细粉状，转至预热的CTAB提取液中，用封口膜将离心管封密以防止巯基乙醇挥发.放回水浴中保温30分钟，保温过程中轻晃几次，保持摇匀.
3. 取出Eppenedorf管.置于冰上迅速冷却到室温，加入等体积的4ml氯仿-异戊醇（24：1），轻微混合均匀且充分，使其彻底地混合成乳状液，然后 4℃下离心12000rpm 10min，轻轻将上清液吸取1ml于1.5ml离心管，放于-20℃冰箱中备用.
各加入液的用途：
（1）去污剂：
CTAB：可将细胞膜裂解，使DNA释放到提取液中，同时也使组织匀浆中的蛋白质变性.
EDTA：能与DNase的辅助因子Mg2+结合，使DNase失去活性，不能降解从细胞中释放的DNA.
（2）还原剂
巯基乙醇：它抑制从细胞中释放的多酚氧仿.防止植物组织发黄变褐.
（3）氯仿—异戊醇：它可把组织匀浆中变性的蛋白质除去，将DNA与细胞中的蛋白质、碳
水化合物等分开除去.
（4）RNase：它可去除核酸中的RNA，只留下DNA.
3.2．总DNA的纯化
操作步骤：
1. 取出1.5ml离心管，内含所取DNA，加入100ul硅珠悬浮液（此液要求先行涡旋再使用），使用涡旋振荡器大约15s，使之充分混匀，于室温静置10分钟，再振荡5秒，后离心：8000rpm 15s 4度，去除上清液得到硅珠——核酸复合物.
2. 将复合物用镊子一次打两个，打成液状，使之完全分散，加入漂洗液1ml，再涡旋充分混匀，后离心8000rpm 15s 弃掉上清液.
3. 重复上一步一次.
4. 用70%的1ml乙醇将硅珠——核酸复合物漂洗两次.每次涡旋充分混匀后，离心8000rpm 15s，弃上清液，打散，最后用1ml无水乙醇再漂洗一次，用涡旋混匀离心8000rpm 15s，然后将离心管管口打开倒置在吸水纸上，再将沉淀置于真空冷冻干燥机中风干复合物10分钟.
5. 加入100ulTE缓冲液充分混匀后，于56度水浴中保温10分钟，然后离心12000rpm 5min.取上清液即为所需的DNA.
6. 将余下的复合物再次完全打散（即涡旋），加入100ulTE缓冲液进行第二次重旋，并于56度水浴中保温10min， 12000rpm 5min，取上清液于步骤5管中共存.
7. 将两次二合一的上清液离心混匀14000rpm 10min ，取上清液存于-20℃冰箱中.
仪器的使用
真空干燥器：
在使用前要求先预热30分钟，只打开1号阀门.
打开盖子平衡放入离心管，然后顺次开启2号——3号——4号——5号门.进行干燥处理5分钟.
关闭各阀门.顺序为5号——4号——3号——2号——1号阀门.
各加入液的配制
1、硅珠悬浮液的配制
（1） 称取1.2g硅珠粉，溶解于10ml无菌水中.
（2） 放入4℃冰箱备用.
（3） 使用时先涡旋使其混合均匀.
2、漂洗液的配制
称取GuSCN（可能产生有毒气体，要求在通风橱中进行）120克溶解于100mlTris-HCl(100mM PH6.4)中.要求在60℃水浴中溶解.
3、TE缓冲液的配制
10×TE，500ml配制如下：
将100mM Tris-Hcl（PH=8.0）6.057g与10mM EDTA（PH=8.0）1.8612g溶于400ddH2O中，调PH=8.0，定容到500ml。
3.3.DNA样品浓度、纯度测定
取4ul DNA水溶液用双蒸水稀释到400ul，用紫外分光光度计测定其D23Onm、D260nm、D280nm值.根据D260nm值估测浓度。根据D260nm/D23Onm、D260nm/D280nm值估测其纯度.
（1）浓度计算公式：对于双链DNA而言D260nm为50ug/ml
DNA样品的浓度（ug/ml）= D260nm×稀释倍数×50/1000
（2） 纯度估测标准：纯的DNA溶液其D260nm/D280nm=1.8；D260nm/D23Onm ＞2.0
DNA浓度的精确测定：
去除一定量的DNA，稀释成200ug/ul，配制少量400、200、100和50 ng 的λDNA.取标准λDNA和样品各1ul，进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳.紫外灯下比较样品DNA条带的亮度，并对DNA样品进行定量、调整样品的 DNA的量与100ugλDNA的亮度相一致.
总的DNA 跑出来条带在紫外光下看应该是明亮的一条,没有拖尾的现象,若有的话可能DNA部分降解或提纯的不彻底,含有的RNA较多.虽然SSR对模板的要求不是太严格,具体能否扩出条带,还须实验证明,或重新提取.
2.PCR扩增
SSR-PCR扩增反应体系
1、10ul反应体系：
调温高压灭菌水H2O 5.45ul 5.45ul×a 5.45ul×a×b
10×Buffer 1ul 1ul×a 1ul×a×b
2mM-dNTP 1ul 1ul×a 1ul×a×b
25mu-MgCl2 1ul 1ul×a 1ul×a×b
r-Taq 0.05ul 0.05u×a l 0.05ula×b
Primer+ 0.25ul 0.25ul×a 0.25ul×a×b
Primer- 0.25ul 0.25ul×a 0.25ul×a×b
DNA模板 1ul 说明：a个反应量=不同模板n+2，b为引物数+22、作程序及其注意事项：
1) 分装各型枪头.
2) 分装各型离心管.
3) 顺次用碳笔标明引物号，小master顺序号及总master顺序号.、
4) 收取冰块半盘，将取出各液放于冰上.
5) 配总master，先计算好a×b
6) d-NTP和MgCl2要求加样前先轻微涡旋混匀， Taq酶要求在冰箱口取用.
7) 配master的顺序：H2O——Buffer---dNTP---MgCl2---Taq
8) 轻涡旋总Master
9) 分装C个引物个小Master
10) 向C个小Master加入C个引物
11) 将含引物的C个Master涡旋混匀
12) 将N个模版点加到N×C个小离心管中，各含1ulDNA
13) 将各小Master，每9ul加入到含1ulDNA的离心管中
14) 时刻注意更换枪头，防止交叉感染，尽量不要将枪头放在液面下.
15) 将扩增好的DNA进行溴酚蓝点样，每离心管8ul
3、各加入液的配制
（1） 引物的稀释
1) 每管引物先1000rpm 3min进行离心，将附在管壁上的粉末或膜状物离心到底部，小心打开盖子.
2) 加入经高温高压的灭菌水.针对不同的引物加入不同的量
3) 使最终浓度都为10um/L
（2） 溴酚蓝的配制
1) 将0.125克溴酚蓝，20克蔗糖溶解为50ml的ddH2O
2) 再进行过滤
3) 放于4℃冰箱中储存
（3） Buffer的配制
1）1×TE Buffer
组成浓度：10mM Tris-HCl 1mM EDTA PH=8.0
配制量：500ml
配制方法：量取下列溶液于500ml烧杯中
1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml
0.5M EDTA PH=8.0 1ml
向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存.
2）10×TE Buffer
组成浓度：100mM Tris-HCl 10mM EDTA PH=8.0
配制量：1000ml
配制方法：量取下列溶液于1升烧杯中：
1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 100ml；
0.5M EDTA PH=8.0 20ml
向烧杯中加入约800mldd H2O均匀混合；将溶液定容到1升后，高温高压灭菌；室温保存.
1MTris-HCl 的配制：
组分浓度：1M PH=7.4 7.6 8.0
配制量：500ml
配制方法：称取6.057克Tris置于500ml烧杯中；加入约400ml的 dd H2O充分搅拌溶解；按下表量加入浓盐酸调节所需PH值
PH值 浓盐酸量
7.4 35ml
7.6 30ml
8.0 21ml
将溶液定容到500ml；高温高压灭菌后，室温保存.
PCR反应体系
1、本实验样品所采用的反应程序：
2、PCR扩增仪的操作：
1）先通过观察哪个指示灯是空的扩增仪
2）右旋打开盖子，按顺序摆放并用手柄轮压实
3）做旋盖好盖子至刻度处
4）打开操作程序，选好人名反应体系并逐一确定
5）掌握扩增仪时间2:30降温需30分钟
聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE
PAGE操作流程及注意事项：
1、涂胶
1） 将有耳玻片（耳朝下）泡于反硅化剂中，新液25分钟，旧液30分钟.
2） 涂无耳正面玻片硅化剂.均匀点四滴，轻而匀的沿一个方向涂三次，静10分钟.
3） 到时间取出.打开通风橱风干30分钟.
2、封胶
1） 将两玻片对贴于橡胶框中，放平，用力拧死，夹住橡胶管.
2） 溶废琼脂胶，分两次：第一次50秒，第二次10-20秒，防止沸出.
3） 用小细长枪头通透加胶枪头，便于加样通畅，少起气泡.
4） 吸2500-3000ul液胶加速沿玻片边缘快速顺下滴，将两面玻片充分封死，防止漏胶.以水平底线面水平高于底为佳，静止凝胶15分钟.（有时可先在封口加一点TBE以润滑玻片，利于胶流下）
3、灌胶
1) 用长细枪头透开加胶枪头
2) 从中间加入，每次不要全部打完，留一点在枪头内.防止断流而导致胶中含有气泡.
3) 插梳子时两端平整，梳子紧贴玻板，梳齿头部不可有气泡.
4) 拔梳子时先加一倍TBE液将梳子泡透，然后平行用力拔出.
5) 在插梳子15分钟内跟踪观察，适当下按，保证孔的深度.
6) 等待2小时，以便胶充分凝固.
4、吹孔
1） 向中间槽加入1倍粗制TBE，要淹没过内玻片约1厘米.
2） 拔梳子，小心平稳，均匀平衡.
3） 调1000p枪到300-600ul，进行吹孔，将小孔内沉淀物吹打干净，加样中再视时吹孔.
5、加样
1） 用细长专用枪加入DNA 0.5ul.
2） 一手托另一臂的肘，以保证加样手不抖.
3） 一定垂直加到孔中去，不脱尾，不吸水，不靠壁，干净利落.
4） 加完一次.在放于桌旁的吸纸上，将细枪头上余液吸干.
5） 首、中、尾各留1到2个孔，两面胶孔的Marker不完全一样，以便区分.
6） 加Marker 0.15ul 一般取0.3ul每孔注如一半，可用两个孔.
6、跑胶
1) 向两侧槽中加入粗制TBE，至U管线处.
2) 打开电源，稳压到120V
3) 电泳2h左右
4) 当样品跑到底部2cm处，关闭电源.
7、撬玻片
1） 刀片不伸入过深.刀片平行于玻片，稍用力.
2） 将没有硅化剂的无耳玻片放于水盘中，还有梳子.
3） 清理琼脂胶，放于烧杯中.
4） 胶玻片放于盘中，银染.
各加入液的配制
1、反硅化剂的配制
1） 量取500ml ddH2O.
2） 用冰乙酸把ddH2O PH调至3.5.
3） 再加Bind-silica 2ml.
4） 用热磁力搅拌器搅拌均匀.
2、TBE电泳母液（10×）的配制
1） 分别称取54克Tris碱，27.5克硼酸，20ml 0.5mol/EDTA（PH=8.0）
2） 将各组分别加入1升烧杯中，用ddH2O定容到1升.
3） 在电泳时使用1倍工作液，按1：4与水混合.
4） 1倍液是为了增加电泳工作液的电流的电流量.
5） 盛于玻璃瓶，在室温保存.
3、聚丙烯酰胺的配制（8%）
组分浓度：80%
配制量：500ml
配制方法：量取210克尿素，1克甲叉，39克丙烯酰胺，放入500ml烧杯中.加入少量水及10×TBE 50ml，用搅拌器搅拌均匀，用微波炉加热四次（约20秒）助热溶解，透明无杂质.用双蒸水定容，溶后于4度冰箱保存.（有杂质需过滤）
4、灌胶液的配制
对于使用的灌胶要在8%胶中加入东西.取35克8%胶液，向其中加入175ul 10%APS和35ul TEMED；缓慢混合，不可使其产生气泡.（10%APS：取1g 过硫酸铵，加入10ml高温灭菌水）
银染操作步骤：
（1） 取下带胶玻璃板，用dd H2O冲两次，每次2分钟.
（2） 用固定液固定10分钟.
（3） 用dd H2O清洗两次，每次2分钟.
（4） 加AgNO3溶液，银染6到7分钟.
（5） 用dd H2O清洗两次，每次2分钟.
（6） 加入显影液，静候20到30分钟至显出图像为止.
（7） 用自来水冲洗，贴上顺序标签.
（8） 拍照近景端平，保持标签清晰.
各加入液的配制
1、显影液的配制
量取50ml 30%NaOH（15g）、10ml 0.756%四硼酸钠和10ml甲醛，用双蒸水定容到1升；在室温保存.
2、固定液的配制
称取200ml无水乙醇和10ml纯乙醇，加入2升烧杯中，用dd H2O定容道2升
3、AgNO3的配制
量取AgNO3原液2500ul；将250ml dd H2O和2500ul AgNO3加入胶玻片上.
（AgNO3原液的配制：50ml 中含AgNO3 7.5g 浓度为0.15g/ml）