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(QGEN) 22.37 : Qiagen宣布，已收购DxS Ltd (DxS)，後者为未上市公司，制造与开发搭配诊断产品，收购价为9500万美元现金，如果达到预订财测目标，将另外支付3500万美元。

QIAGEN公司收购DxS有限公司 -创造个性化医疗的领导
此外，QIAGEN公司推出首次管道及其配套的诊断，该公司认为是在深度和剖面上无与伦比
芬洛，荷兰，2009年9月22日 - QIAGEN公司内华达州（纳斯达克股票代码：QGEN;法兰克福，总理标准：卡塔尔投资局）今天宣布，它已经收购DxS有限公司（DxS），是一家私人 控股开发商和总部设在曼彻斯特的同伴诊断产品制造商，英国。此次交易是大约95美元的现金万美元（符合通常的收购价格调整），加上高达另外3500万美 元，如果指定的商业和其他里程碑满足。

通过这次收购，QIAGEN公司采取了在个性化医疗保健（PHC）的新时代强有力的领导地位。该公司认为，它提供所有必需的元素，以帮助推动和塑造这个迅速崛起的医疗趋势。

此外，QIAGEN公司公布了第一次合并后的公司目前超过15与制药公司的市场和/或诊断产品开发的合作伙伴积极。该规划涵盖基因，表达，后生和其他标记。 QIAGEN公司认为，这条管道是最深的个性化医疗的分子诊断等关键领域的投资组合。

收购DxS

在DxS收购使QIAGEN公司的分子诊断化验和知识产权组合，以及积极的或计划中的同伴在肿瘤诊断的伙伴关系深厚的渠道与许多领先的制药公司，包 括在这一领域最大的制药公司7 。这些资产的补充QIAGEN公司现有的个性化医疗诊断解决方案组合和强大感到非常QIAGEN公司的样品制备和检测技术的协同作用。

DxS制定了允许分子肿瘤学医生预测病人的反应，某些治疗方式，以使癌症治疗更加有效和安全的诊断化验集。目前正在销售的产品组合涵盖7实时PCR 检测，其中包括一个基因突变的地位k - ras基因，这对来自转移性结肠癌（mCRC与表皮生长因子受体抑制剂）患者的治疗成功的指标测试。此外，三个化验是在短期内管道，并进一步分析得到的中 期正在酝酿中。 DxS'组合化验，都在其销售和管道，是非常适合与QIAGEN的平台手段，包括QIAsymphony和转子基因问：现有的套件使用

DxS是带来了哪些分子伴侣诊断市场的先驱者之一。在TheraScreen：K - ras基因突变试剂盒®由DxS开发已经CE的标记。在美国，测试预计将提交监管机构批准，在2010年（物业管理公司）向FDA。据估计，在未来的市场 整体亩- ras基因测试可能可达1亿美元。 DxS目前的产品组合，短期产品包括10独特和专有化验。公司积累了其现有的和计划的诊断内容的重要的知识产权组合。

他说：“DxS收购QIAGEN公司的战略是非常重要的交易。它结合了两个领导职务，以创建一个在医疗领域的变革非常强大的领导者：个性化医疗。这 项交易是我们的战略，带领分子诊断的关键因素，为基础的预防，分析和个性化医疗。这三个因素将大大形状，并有助于今后改进和保健有可能提供巨大利益的病 人，以及为纳税人，提供卓越的价值，以及制药业“，说：同行米沙茨，对QIAGEN公司首席执行官。

“QIAGEN公司是DxS理想的合作伙伴在全球范围内推出的化验，以我们的伙伴关系提升到更高层次，并采取了同伴诊断的领导地位”，斯蒂芬说 小，DxS的创始人和首席执行官。 “与任何其他公司，我们认为，QIAGEN公司谈到对大型制药和生物技术公司的同伴诊断范围最广的选择 - 从一个独立的销售开始达到了广泛的技术，研发和制造能力达到了监管事务和获得医生的专业知识创造和实验室。“

“这样的组合有可能的每个人创造经典双赢”，说同伴沙茨。 “我们相信，QIAGEN公司可利用其增强的战略地位，充分利用机会，在个性化医疗：医药客户可以从一个更强大，独立的和有重点的合作伙伴的利益更好地满 足他们特殊的发展需要，员工可以受益于增加就业机会，医生可以受益更快的访问的诊断和治疗，以更好的工具，可以从医疗保健系统的潜在利益为切实有效的治疗 增加。但最重要的是，病人谁严重的疾病，如癌症，痛苦，从中获益，这些新的趋势显着在个性化医疗，从而导致不必要的，甚至有害的治疗，因此，以避免在他们 的生活质量的提高。“

DxS的高级管理层将加入该公司在迅速发展的个性化医疗的重点领域，促进对这一关键部门进一步扩大的快速集成和集中领导作用QIAGEN公司。为 此，QIAGEN公司打算建立一个在曼彻斯特在制药，携手共建卓越中心DxS的总部。鉴于高层次的协同作用，QIAGEN公司预计将增长曼彻斯特的位置。

交易亮点

QIAGEN公司认为它采取了一种个性化的医疗保健分子诊断的领导地位，致力于帮助推动和塑造这个迅速崛起的趋势。
QIAGEN公司推出首次在其合作伙伴的诊断管线深度和目前正积极的伙伴关系超过15英寸这被认为是在该行业最这种管道之一。
QIAGEN公司扩大了个性化医疗，在公司战略的一个重要支柱，把重点放在领导的分子诊断为基础的预防，分析，和个性化医疗。
QIAGEN公司造成了同伴诊断领先的投资组合：
DxS增加了7个基因化验目标包括K标志物，RAS和EGFR29，这可能是确定病人的反应，某些癌症治疗有用（如结肠癌，肺癌）。
QIAGEN公司现有产品已经包括焦磷酸的k - ras基因，携带BRAF和甲基化标志物化验目标，以及基因表达和对未来的标记及仪器平台miRNA的化验发现大批自动完成这些测试。
吸积调整后每股收益在2010年以后。
非常协同，避免重叠和无缝集成预期。 DxS'高级管理人员将继续承担在扩大与制药和生物技术在同伴诊断QIAGEN公司的伙伴关系的领先地位。

财务细节

根据协议条款，QIAGEN公司收购DxS整个发行股本。 QIAGEN公司预计，支付一次性在2009年第三季度的费用大约在每股0.02美元，与此次收购有关。这些费用主要涉及咨询，并与收购和注销而发生的某 些资产的咨询费用。此外，根据初步分析，并按照投资组合的简化，QIAGEN公司预期这一交易将有助于在2009年余下的销售额约为600万美元和30美 元左右，在2010年的销售亿美元。经过调整后不包括一次性支出，整合和重组费用，和收购相关的无形资产摊销，收购预计将在中立2009年剩余的EPS和 美国将在2010年摊薄$ 0.02。 2010年以后，预计此次收购将增加每股收益调整。杰弗里斯担任此次交易的独家财务顾问。

关于QIAGEN公司在分子诊断

有了一个运行速度超过美国的4.5亿美元的销售额，并在该领域的快速增长，QIAGEN公司认为它是在分子诊断的领导者，包括病毒载量检测和血液检测。

QIAGEN公司确定了三个领域的实验室为基础的，是专注于分子诊断：

预防：这部分涵盖在早期疾病或风险的目的，无症状患者的检测和定期检验标志。这些化验是通常由大批量实验室。 QIAGEN公司的投资组合，HPV检测，此外，在化验的发展小组（包括衣原体和淋病的测试）解决最具吸引力和预防增长最快的细分市场。这些化验就可以执 行现行制度和QIAGEN公司QIAensemble平台。该平台预计将于2010年底在欧洲和美国在2012年中推出，并可望在吞吐量和实用性方面，在 分子诊断筛查的新标准。
分析：这部分包括对症状的病人，建立或确认的诊断测试。这些化验大多表现在较低的流量，但往往是更高的每测试值。 QIAGEN公司的分子（“80病原体）诊断化验组合被认为是世界上最广泛的一个，用于检测和配置病原体。这部分还包括遗传和其他化验数目。
个性化医疗保健：QIAGEN公司认为，这是大多数分子诊断领域的变革。这些化验是用来指导治疗前诊断症状的病人。他们是典型的高价值，低量化验。 QIAGEN公司今天出售约20个性化医疗化验。
在个性化医疗保健和分析吞吐量需求低于在预防部分，但对带宽的要求（样本种类等）要高得多。随机存取，连续负载QIAsymphony平台（样本的结果，其中第一单元已经非常成功地发射）是为这些细分市场设计的。

关于QIAGEN在个性化医疗保健

QIAGEN公司认为，它带来了特殊的价值主张为伴侣诊断制药公司的发展项目。该公司被认为是一个重要伙伴，因为它是：

最大的分子诊断公司的收入为基础，技术和产品组合宽度，外验血/病毒载量检测。
一个重要供应商，医药发现与开发已经今天。
一个广泛的技术组合所有者分子样品和检测技术。
独立：没有一家制药公司所拥有。
具有强烈的监管存在的公司，销售渠道的实力和全球影响力。

关于伴侣诊断和个性化医疗保健

同伴诊断预计将成为一个关键因素，实现个性化医疗（PHC）的变革趋势。除了对肝癌的重大利益日益认识到医疗保健的主要参与者（付款人，医生，管理 者，病人），在分子诊断新的可能性，特别是最近的监管和付款人的决定，特别是围绕产品在DxS'组合起到了关键作用，加快朝着更为一体化的诊断信息来指导 治疗的趋势。

虽然最新的同伴诊断为“改装”的诊断，即增加了追溯批准的药品，以改善结果，即诊断，诊断的同伴新一代正在开发的药物一起预测病人群体反应的药物治 疗，提高其疗效和安全。通过有关的某些特定基因变异生物标志物检测，保健专业人员可以自定义他们的治疗，避免不必要的或有害的治疗。个性化医疗观念在临床 领域，如心血管疾病和神经系统疾病和 - 最显着的 - 癌症治疗的决定，在日益重要的作用。有28个同伴的有效基因组由美国食品药品管理局确定的范围内的生物标志物FDA的批准的药品标签的诊断测试。据业内人 士报道，个性化医疗市场每年增长24％，在过去十年中，达13美元，2008年亿美元。

关于QIAGEN：
QIAGEN公司内华达州，一家荷兰控股公司，是全球领先的样品制备和检测技术的全球供应商。样品制备技术用于隔离和处理DNA，RNA和蛋白质的生物样 品，如血液或组织。检测技术可用于制造这种孤立的生物分子可见。 QIAGEN公司已经开发和市场500多个样品，检测产品，以及自动化解决方案等消耗品。该公司提供其产品的分子诊断实验室，学术研究，制药和生物技术公 司，和应用测试用途，如法医，动物或食品检测和制药过程控制客户。 QIAGEN的检测技术包括分子诊断测试的最广泛的一个小组在全球推出。这个小组包括杂交捕获HPV检测，这是一个“黄金标准高的人乳头状瘤病毒 （HPV），是宫颈癌的主要成因，以及对传染病的测试解决方案的一整套风险类型测试”视为和同伴诊断。 QIAGEN公司雇用了30多个地点的超过3,200名员工。有关QIAGEN公司的更多信息可在http://www.qiagen.com/。
关于DxS：
DxS是一家公司，提供个性化医疗的分子诊断，以帮助他们选择（伴侣诊断）分子配置为病人安全，有效的治疗医生和制药公司。在曼彻斯特，英国，该公司总部 设在两个国家约80名员工，其中大部分在英国。更多关于DxS信息可在http://www.dxsdiagnostics.com/

高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术 (next generation sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。
自从2005年454 Life Sciences公司（2007年该公司被Roche正式收购）推出了 454 FLX焦磷酸测序平台（454 FLX pyrosequencing platform）以来，曾推出过3730xl DNA测序仪（3730xl DNA Analyzer） 的Applied BioSystem（ABI）这家一直占据着测序市场最大份额的公司的领先地位就开始动摇了，因为他们的拳头产品毛细管阵列电泳测序仪系列 （series capillary array electrophoresis sequencing machines）遇到了两个强有力的竞争对 手，一个就是罗氏公司(Roche)的454 测序仪(Roch GS FLX sequencer)，，另一个就是2006年美国Illumina公司推出的Solexa基因组分析平台（Genome Analyzer platform），为此，2007年ABI公司推出了自主研发的SOLiD 测序仪(ABI SOLiD sequencer)。这三个测序平台即为目前高通量测序平台的代表。（见表一）

表一：主流测序平台一览

这些平台共同的特点是极高的测序通量，相对于传统测序的96道毛细管测序，高通量测序一次实验可以读取40万到 400万条序列。读取长度根据平台不同从25bp到450bp，不同的测序平台在一次实验中，可以读取1G到14G不等的碱基数，这样庞大的测序能力是传 统测序仪所不能比拟的。尽管如此，在这项新的划时代的测序技术刚出现的时候，科学界对这项新技术却并不热衷。许多习惯用桑格技术的科学家怀疑新技术的准确 度、阅读能力、成本消费、实用性。代理Sanger型测序硬件的经销商害怕其投资失败而首先提出了这些怀疑。

然而大多数人却忽略了一个事实，即桑格技术的普及最初也遇到同样的阻碍。桑格技术刚开发出来时，阅读能力很难超过 25bp，即使在Fred Sanger双脱氧终止法发明后也只达到80bp，如今却达到了750bp；而新发展的合成测序技术，应用焦磷酸测序方法，其阅读能力最初只有 100bp，推向市场16个月后增加至250bp，随着技术的不断完善，目前已达到了400bp，很快就接近桑格技术目前的水平。除了阅读能力外，能否以 有限的成本用一台仪器产生足够数量的序列标记也是另一个需要改善的重要问题。这个问题已经被Roche公司解决了，应用他们的系统，仅花费阅读35bp或 者更小片段的成本就能产生比35bp多10倍的序列标记。

一、高通量测序的应用
高通量测序可以帮助研究者跨过文库构建这一实验步骤，避免了亚克隆过程中引入的偏差。 依靠后期强大的生物信息学分析能力，对照一个参比基因组(reference genome)高通量测序技术可以非常轻松完成基因组重测序(re-sequence)，2007年van Orsouw等人结合改进的AFLP 技术和454 测序技术对玉米基因组进行了重测序，该重测序实验发现的超过75%的SNP位点能够用SNPWave技术验证，提供了一条对复杂基因组特别是含有高度重复 序列的植物基因组进行多态性分析的技术路线。2008年Hillier对线虫CB4858 品系进行Solexa重测序，寻找线虫基因组中的SNP位点和单位点的缺失或扩增。但是也应该看到，由于高通量测序读取长度的限制，使其在对未知基因组进 行从头测序(novo sequencing)的应用受到限制，这部分工作仍然需要传统测序(读取长度达到850 碱基)的协助。但是这并不影响高通量测序技术在全基因组mRNA表达谱，microRNA表达谱，ChIP-chip以及DNA甲基化等方面的应用。
2008年Mortazavi等人对小鼠的大脑、肝脏和骨骼肌进行了RNA 深度测序，这项工作展示了深度测序在转录组研究上的两大进展，表达计数和序列分析。对测得的每条序列进行计数获得每个特定转录本的表达量，是一种数码化的 表达谱检测，能检测到丰度非常低的转录本。分析测得的序列，有大于90%的数据显示落在已知的外显子中，而那些在已知序列之外的信息通过数据分析展示的是 从未被报道过的RNA剪切形式，3’端非翻译区，变动的启动子区域以及潜在的小RNA 前体，发现至少有3500个基因拥有不止一种剪切形式。而这些信息无论使用芯片技术还是SAGE文库测序都是无法被发现的。
高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子RNA或非编码RNA(ncRNA)研究。测序方法能轻易的解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难 题(短序列，高度同源)， 而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的长度，使得数据“不浪费”，同时测序方法还能在实验中发现新的小分子RNA。在衣藻、斑马鱼、果蝇、线 虫、人和黑猩猩中都已经成功地找到了新的小分子RNA。在线虫中获得了40 万个序列，通过分析发现了18个新的小RNA分子和一类全新的小分子RNA。
在DNA—蛋白质相互作用的研究上，染色质免疫沉淀—深度测序(ChIP-seq)实验也展示了其非常大的潜力。染色质免疫沉淀以后的DNA 直接进行测序，对比ref seq可以直接获得蛋白与DNA结合的位点信息，相比ChIP-chip，ChIP-seq可以检测更小的结合区段、未知的结合位点、结合位点内的突变情 况和蛋白亲合力较低的区段。

二、高通量测序的前景
目前，大多分析家都无法相信新一代测序技术能完全取代目前的芯片测序技术。不过，有些分析家也的确认为芯片测序技术正面临着挑战，他们认为到了2012年新一代的测序技术将会带来高达2。15亿美元的产值。
2006年，整个芯片测序市场大概价值8亿美元，其中65%的市场份额都是有关基因表达谱分析产品的，剩下35%的市场份额则由基因型分析芯片 占据。不过美国哈佛大学（Harvard University）遗传学教授George Church认为，这部分市场也会受到新一代测序技术的冲击。重测序芯片（resequencing arrays）、单核苷酸多态性分析芯片以及基因拷贝数目变异分析芯（copy number variant array）市场也会受到影响。也有分析家不赞同这个观点，他们认为即使新一代测序技术很便宜，还是有不少人会选择传统的测序仪的。
新一代测序技术相对传统芯片测序技术的优势，最终还得依靠广告和市场营销手段的推广才能获得大众的认可。去年夏天，由 Frost & Sullivan公司对学术科研机构和私人研究团体进行的一项调查研究结果表明，在实际应用领域，例如进行表达谱分析时，人们还 是倾向于选择传统的芯片产品，而并非青睐新一代的测序产品。
新一代测序仪推广困难可能由其价格昂贵导致。平均采购一台新一代测序仪大约要花费50万美元，除非该实验室测序的工作量非常大，否则是不会考虑 购买的。即使像Polonator这样的新一代测序仪也需要花费15万美元左右，这笔费用对于一个小实验室来说是无法承受的。这时，只需要150美元一块 的芯片就非常有竞争力了。以基因芯片产品享誉业界的美国Affymetrix公司市场部副总裁Jay Kaufman认为，新一代测序技术对于芯片市场来说的确会带来一定的冲击，不过要完全取代表达谱分析芯片还需要一定的时间。
但是，基因芯片也有其自身的缺点，就在于它是一个“封闭系统”，它只能检测人们已知序列的特征(或有限的变异)。而高通量测序的强项， 就在于它是一个“开放系统”， 它的发现能力和寻找新的信息的能力，从本质上高于芯片技术。 研究者可以充分享受这两个平台的比较优势，在获取新信息的基础上，利用芯片的强项， 即对已知信息的高通量、低成本(相对)的检测能力， 对大量样品进行快速检测，短时间内获得有大量有效的数据。
作为两个高通量的基因组学研究技术，在应用的某些方面存在重叠和竞争，但是在更多方面是优势互补，两种方法联合使用，将解决以前的单种技术难以解决的问题。

三、结语
新一代测序已显示出巨大的潜力。也正是因为科学的不断进步，在给测序技术提出新要求的时候，也给这项技术带来了新的增长点：
2008年4月Helico BioScience公司的Timothy等人在Science上报道了他们开发的真正的单分子测序技术，也被称为第三代测序技术，并利用该技术对一个 M13病毒基因组进行重测序。这项技术之所以被称为真正的单分子测序，是因为它完全跨过了上述3种高通量测序依赖的基于PCR扩增的信号放大过程，真正达 到了读取单个荧光分子的能力，向1000美元测定一个人类基因组的目标迈出了一大步。

NGS之基础篇
2001年，美、英、法、德、日、中六国合作，历时十年，耗资数十亿美元的人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）宣告完成。转眼又是十年过去，在此期间，各国科学家仍在为解读基因的密码而不懈努力，这其中最大的突破，就是第二代测序技术的推 出。HGP的顺利完成证明了我们有能力对自身的遗传信息进行研究，然而，高昂的成本、漫长的时间、巨大的人力需求，无不限制着对遗传密码的进一步认识。从 HGP开始的第一天期，科学家们就在寻求更好的方法来对基因组进行研究，“鸟枪法”就是其中之一。2006年，美国X大奖基金会（www.xprize.org） 设立了奖金高达1000万美元的基因组Archon X大奖，旨在奖励第一个在10天内以低于100万美元的成本完成100个人类基因组测序的民间团队。而罗氏（Roche）、应用生物系统（Applied Biosystems，ABI）、Illumina三家公司先后推出了各自的第二代高通量测序平台，成为NGS领域的领头羊。
2005年底，454公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。随后，罗氏公司以1.55亿美元收购了454公司，并在2006年推出了更新的GS FLX测序系统，该系统可在10小时的运行中获得100万条读长（reads），4~6亿个碱基信息（base pair），且准确率达到99%以上。2008年，GS FLX系统再次升级，通量提高了5倍，读长和准确率也有所增加。虽然454 GS测序平台也许不是市场占有率最高的测序仪，但截至2011年3月，利用该系统进行研究的论文已发表超过1000余篇，而它在读长上的优势明显胜于另两 套系统，因此在从头测序（de novo）和宏基因组测序（meta genome）方面有着不可替代的地位。
2006年，Solexa公司也推出了自己的NGS系统——Genome Analyzer，简称GA。这套基于DNA簇（DNA cluster）、桥式PCR（Bridge PCR）和可逆阻断（Reversible terminator）等核心技术的系统具有高通量、低错误率、低成本、应用范围广等优点。2007年，Illumina公司以6亿美元的高价收购了 Solexa，使GA得以商品化。GA最早期的版本一次运行可获得1Gb的数据，因此也有1Gb Analyzer的含义，而最新的Hiseq2000平台则能够在10天的运行中获得300Gb以上的数据，读取的碱基长度达到150bp左右。更有消息 称，Illumina已完成了600Gb的运行测试并在部分客户中开展了前期体验，Tb（1000Gb）级的测试Run也将于年内进行。据不完全统 计，Illumina公司已售出超过600台/套GA IIx和Hiseq2000平台，2010年仅深圳华大基因研究院一家就购买了128台Hiseq2000，一举成为全球最大的基因组测序与分析中 心，Illumina公司在测序领域的影响力由此可见一斑。
在Sanger测序时代，美国应用生物系统公司（ABI）一直是该行业的龙头老大，其垄断地位无人能撼，从早期的377到全自动化的3730xl，ABI 的测序仪被广泛应用在基因组学研究的各个方面。然而在第二代测序技术迅猛发展之初，ABI起步较晚，显得有些漫不经心。直到2005年454公司推出GS 平台，ABI的领先地位受到威胁，这才开始发力，迅速收购了研发NGS的一家小公司Agencourt，并于2007年推出了它的SOLiD测序平台。此 后SOLiD不断升级，目前已到SOLiD 5版本（SOLiD 5500xl）。SOLiD的全称是Sequencing by Oligo Ligation Detection，即寡聚物连接检测测序，其基本原理是通过荧光标记的8碱基单链DNA探针与模板配对连接，发出不同的荧光信号，从而读取目标序列的碱 基排列顺序。在该方法下，目标序列的所有碱基都被读取了两遍，因此SOLiD最大的优势就是它的高准确率。据悉，SOLiD 5平台的测序通量已达到30Gb/天，成本低于60美元/Gb，准确率高达99.99%。并且由于SOLiD系统采用的不是PCR反应进行DNA合成与测 序，因此对于高GC含量的样本，SOLiD系统具有非常大的优势。
宣传视频：
Solexa
http://www.illumina.com/Media/flash_player.ilmn?dirname=systems&swfname=GA_workflow_vid&width=780&height=485&iframe
SOLiD
http://media.invitrogen.com.edgesuite.net/ab/applications-technologies/solid/solid-5500.html

NGS之进阶篇
454的焦磷酸测序原理，简单来说就是利用DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用，将PCR反应每一个碱基（dNTP）的延伸与一 次荧光信号的释放偶联起来，通过记录荧光信号的有无和强度，达到实时测定DNA序列的目的。在454测序仪中，A、T、G、C四种碱基是分别存储在单独的 试剂瓶中的，每步反应四种碱基依次加入反应池，当碱基配对结合，就会释放出一个焦磷酸（PPi），而这个焦磷酸在酶的作用下，将荧光素氧化成氧化荧光素， 并发出光信号，从而读取出这一位置的碱基信息。
454测序仪的整个实验步骤可大致概括为：样品处理、文库制备、emPCR、反应板准备、上机测序。样品处理主要是针对大片段的DNA分子，如基因组 DNA、Fosmid或BAC质粒等，利用超声或氮气打断将这些DNA分子片段化，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化，选择500-800bp的 DNA片段。对于非编码RNA或PCR产物，则不需要这一步骤。文库制备包括接头连接和磁珠纯化两步，454的文库接头分A、B两种，各44bp，由 20bp的PCR引物、20bp的测序引物及4bp（TCAG）的“key”碱基构成，其中B接头的5’端带有生物素（Biotin）标记，用于磁珠纯化 步骤。经过磁珠结合与DNA变性之后，只有A+目的片段+B形式的连接产物得以富集，另两种形式（AA、BB）的产物都被去除。emPCR是454测序的 一个关键步骤，将富集到的文库与测序磁珠、各反应物混合，加入特定的矿物油和表面活性剂，再利用振荡器剧烈振荡，使反应体系形成油包水（water- in-oil）的稳定乳浊液。在理想条件下，每一个液滴，或称微反应器（microreactor）中将只包含一个磁珠和一条单链DNA，通过控制该步骤 的条件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方个理想的微反应器。经过PCR扩增后，每一个磁珠上将形成密集的DNA簇，这些DNA序列完全相同，即可用 于后续的步骤。454测序的反应板称为PTP（Pico Titer Plate），含有350万个由光纤组成的小孔，每个孔的直径为29μm，而测序磁珠的直径为20μm，因此每个孔中仅能容纳一个磁珠。将磁珠与测序试剂 加入PTP中，使之可用于上机测序。测序步骤如前所述，四种碱基在泵的控制下依次加入反应板，反应完成后再洗去，每延伸一个或若干个碱基，就会发出一次光 信号，通过记录信号的有无和强度，即可测定DNA序列。
454测序准确度较高，当读长超过400bp时，其准确性仍能达到99%以上，主要的错误来自于同聚物，即相同碱基的连续延伸，如ATTTG这样一段序 列，A和G的读取没有问题，但T只记录了一次光信号，仅信号强度与ATG序列的T有所不同，因此同聚物越长，可能产生的误差就越大。目前，由于454测序 仪在读长上的明显优势，它在大基因组从头测序（de novo）、转录组分析、基因组结构分析等领域有着广泛的应用。

以下图片：1. 454 GS FLX测序仪外观；2. 3（4）种连接产物的磁珠纯化；3. PTP板与测序磁珠；4. 454 GS测序峰图；5. 上机准备实拍图。

NGS之进阶篇二：Solexa

Illumina Solexa高通量测序平台可以说是目前“测序界”应用最广泛的NGS平台，它在兼容性、操作性和成本方面有着较大的优势，第一个亚洲人基因组“炎黄一 号”、第一个非洲人基因组、熊猫基因组、家蚕基因组甲基化图谱等等，都是在该平台的支持下完成的。从最初的GA到GA IIx，又更新换代为现在的Hiseq2000，Solexa测序平台的通量由1Gb/run一路提升至300Gb/run，预计在年内还将实现1Tb /run的升级，测序读长也从几十bp提高到150bp。当年的人类基因组计划用了10年时间完成了一个基因组的精细图，而现在使用Hiseq2000测 序仪只需10天左右的时间，即可完成至少3个人类全基因组的测序工作，NGS测序能力的飞速发展甚至超过了IT届的摩尔定律。
与454一样，Solexa测序平台所采用的也是SBS（Sequencing-by-Synthesis，边合成边测序）的方式，并且也利用光信号收集 信息。有所不同的是，Solexa并没有采用间接反应（焦磷酸氧化荧光素）的形式激发光信号，而是直接在dNTP上连接荧光基团和阻断基团，通过“去阻断 —延伸—激发荧光—切割荧光基团—去阻断”这样一个循环的方法来依次读取目的DNA上的碱基排列顺序。如下图所示，该原理在基础篇的Solexa宣传视频 中亦有提及。由于采用了可逆阻断技术（即在dNTP上连接可剪切的阻断基团），Solexa测序的每一步只延伸一个碱基，不会出现类似于454测序的同聚 物影响准确性的问题，因此其单碱基准确性较高，但随着读长的增加，荧光信号会有所衰弱，所以越“靠后”的碱基准确性会逐渐降低，这也是Solexa测序读 长受限的一个主要因素。

Solexa平台的应用范围极广，几乎囊括了目前基因组学研究的所有方面，例如基因组从头测序（de novo）、重测序（re-sequencing）、基因组结构分析、转录组测序、表达谱分析、小RNA及非编码RNA测序、表观遗传学研究等等。然而， 应用该平台的核心过程是大致相同的，这也为它的兼容性提供了很大的便利。Solexa测序的实验流程主要包括：样品处理、文库制备、芯片准备及上级测序。 根据实验目的和样品来源的不同，Solexa测序的样品处理也有所不同，基因组DNA需进行打断及片段选择，total RNA需富集mRNA或小RNA，mRNA也要进行片段化处理，ChIP（染色质免疫共沉淀）、甲基化及PCR产物等都有各自的处理方式，需要实验人员根 据情况进行选择。以基因组DNA测序为例，在获得样本后，首先需要对DNA进行检测，保证样本的浓度和完整性符合实验要求，然后使用超声或氮气打断，将这 些DNA分子片段化，这步与454的样品处理类似，但不需要收集特定范围的DNA片段即可用于下一步实验。文库制备过程可分为末端修复、3’端腺苷化、接 头连接、片段选择、PCR扩增以及文库纯化六个步骤。末端修复是将片段化的DNA分子在几种酶的作用下，补齐随机打断造成的黏性末端而成为平末端。3’腺 苷化目的是在DNA双链的3’端加上dATP，以便于下一步的接头连接。Solexa文库制备所用的接头（adapter）是一个一端互补，另一端开叉Y 字形DNA片段，互补的部分5’端有一个T，可与3’腺苷化的DNA进行T-A连接，开叉的部分则是为了通过PCR扩增引入测序引物P5和P7的互补序 列。接头连接完成后，再采用采用琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化获得特定大小的片段（通常为目的片段大小+120bp），如构建200bp文库，则回收 320±20bp的DNA。之后再进行PCR扩增和纯化，即得到可用与上机测序的文库。此时的文库DNA由待测序列、测序接头、引物互补序列及index 标签序列（如非index文库则无），如下图所示。

芯片准备与上机测序主要由机器完成，在此不做赘述，若想做进一步了解，可访问Illumina官方网站的技术支持：http://www.illumina.co ... chnology.ilmn。
同样，最后献上几张图片：1. cBot芯片制备仪与Hiseq2000测序仪；2. Solexa GAII测序芯片；3. Solexa测序光信号采集直观图；4. Solexa测序流程与原理示意图。

人类基因组计划的核心内容之一是基因组测序。随着人类基因组图谱趋于完成，人类基因的 定位克隆、鉴定分析直至全基因组测序取得了突破性进展，测序策略的成熟、测序方法的改进、自动测序仪的广泛应用、计算机数据分析系统的扩展以及测序分析能 力的提高， 大大推进了大规模DNA测序的进程。

第一节 DNA测序的基本方法

一、Maxam-Gilbert的化学降解测序法

①先用限制性内切酶把DNA切成10～200bp 的测序材料，②用碱性磷酸化酶处理该片段，消除5′末端上的磷酸，③在5′OH端标记32P，用多核苷酸磷酸激酶催化，④标记片段变性为单链，⑤化学试剂 在特定碱基位置降解单链DNA，产生一组长度不等的DNA片段，⑥经电泳和放射性自显影后，从4个反应系统统一阅读，待测DNA的全部核苷酸序列就可直接 读出。

二、Sanger的酶降解测序法（链终止法）

这项技术的关键是在DNA的聚合过程中依赖特殊反应底物（2′3′-双脱氧核苷三磷酸ddNTP）的特异性终止进行DNA测序。

第二节 DNA测序的策略

一、定向测序策略

定向测序策略是从一个大片段DNA的一端开始按顺序进行分析。传统的方法是用高分辨率限制酶切图谱确定小片段的排列顺序，然后将小片段亚克隆进合适的克隆载体并进行序列分析。

二、随机测序战略

随机测序战略又称鸟枪战略（shotgun strategy），此策略是将人类基因组DNA用机械方法随机切割成2Kb左右的小片段，把这些DNA片段装入适当载体，建立亚克隆文库，从中随机挑取克隆片段。最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段DNA序列。

三、多路测序战略

多路测序战略（Multiplex method）是鸟枪法的一种发展策略，是通过多个随机克隆同时进行电泳及阅读，快速分析DNA序列的一种技术。这种方法的复合随机克隆文库来源于相同的 基因组DNA。将DNA片段克隆到20种不同的质粒载体上，再亚克隆进不同的质粒载体。将来源20个亚克隆库的克隆。

四、聚合酶链式反应（PCR）

反应程序包括三个步骤：(1)DNA双链加热(94℃)变性成单链；(2)加入两种DNA单链引物，分别与两条模板链退 火（55℃）；(3)DNA聚合酶从两引物的3′端按模板要求合成新生DNA链（72℃）。重复操作，可使DNA快速扩增，20个循环后可使模板DN A扩增1万倍，30个循环后可使模板DNA含量放大100万倍，只需2个多小时的时间。

五、大规模DNA测序的趋势——自动化

DNA测序实现规模化的重要条件是自动化和机械化。目前，DNA制备、克隆文库组建及筛选、DNA测序分析、数据的分析获得、碱基序列阅读、重叠克 隆群顺序排定等过程均已平行发展，自动化操作紧随其后。随着DNA测序不断由半自动化向自动化过渡，原始数据积累将不成问题，关键是把全基因的散测序组装 起来，以实现DNA测序的完整性。目前，在亚克隆筛选、模板制备、测序反应、碱基阅读等方面均在一定程度上实现了自动化。

1、 克隆筛选 从亚克隆文库中寻找并筛选单一克隆已逐步实现了自动化。

2、模板制备 现有的机器人被用来自动分离DNA并制备适于传统操作程度的测序模板。特定用途的DNA分离仪也已采用。

3、 测序反应 由于手工测序不能保证所需的再生产能力、高通量和准确的重复性，所以，DNA 测序反应的自动化对大规模测序是至关重要的。

4、自动放射性自显影阅读机 近几年来，自动化放射性自显影阅读机纷纷上市，并不断向商业化及科研应用方向发展。

5、自动测序仪 DNA自动测序仪的应用实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化。

第三节 未来的测序技术

一、质谱法（mass spectrometry）
新型的电离技术如电喷雾离子化和基质辅助激光吸收技术使利用质谱法 分析大片段DNA成为可能。其中四极离子捕获效果更好。Fourier转型质谱或飞行时间质谱可进行极为敏感的DNA测序。

二、杂交测序法（seguencing by hybridization，SBH）

杂交测序法是一种创新性的DNA测序技术，主要是采用一系列n-mer长的所有可能的寡核苷酸与未知DNA靶序列进行杂交，记录下最适的杂交片段，然后组装便可获得未知片段的碱基序列。

三、单分子测序法（single-molecule seguencing）

单分子测序法是美国Los Alames国家实验室（LANL）)发展的一种通过检测标记在单个分子上的荧光进行DNA快速测序的方法。模板DNA分子首先通过酶法修饰或合成，使不 同的荧光素标记不同的碱基，然后，用两个激光束（或称激光镊子lasertweezer）夹住标记的DN A分子，将其置于液流系统，从被固定的核苷酸上游端开始用外切酶逐一切下被标记的核苷酸，通过单分子荧光探测器检测液流中切下的标记核苷酸，再根据检测到 的信号顺序确DNA顺序。

四、原子探针显微镜测序法（atomic probe microscopy）

80年代发展的原子探针显微镜技术如扫描遂道显微镜（scanning tunneling micro scopes，STM）和原子力显微镜（atomicforce microscopes，ATM）使直接检测DNA分子结构成为可能。STM是由IBM Zurich研究所的科学家发明的用来直接观察单分子、单原子结构的技术，最近有人将其应用于阅读DNA序列。

五、超薄水平凝胶电泳技术（Horizontal Ultrathin Gel Electropho resis，HUGE）

1990年，Swerdlow H首次采用HUGE技术进行DNA测序研究。该技术是在单一超薄凝胶平板上放入多道平行样品，在超高压电场作用下，通过HUGE检测系统进行测序。

转载自丁香园
测序在生命科学研究中一直发挥着重要作用。以Sanger法（双脱氧核苷酸末端终止法）为代表的第一代测序技术帮助人们完成了从噬菌体基因组到人类基因组图谱等大量测序工作，但由于其存在成本高、速度慢、通量低等不足，并不是后基因组时代最理想的测序方法。

进入21世纪后，以Roche 454、Illumina Solexa和ABI SOLiD为代表的第二代测序技术诞生了，并迅速掀起了你追我赶的技术比拼高潮。2010年，Illunima和ABI先后发布新款测序仪，改进了原有机型，测序通量不断提升，测序成本不断降低，现在已经进入了数千美元测一个人全基因组的时代。

第二代测序技术进展

1. Roche 454测序技术

454公司可谓第二代测序技术的奠基者。2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的高通量基因组测序系统--Genome Sequencer 20 System。这一技术的建立开创了边合成边测序（sequencing by synthesis）的先河，被nature杂志以里程碑事件报道。之后，454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。一年后，他们又推出了性能更优的第二代基因组测序系统--Genome Sequencer FLX System（GS FLX）。2008年10月，Roche 454在不改变机器的情况下，推出了全新的测序试剂--GS FLX Titanium，全面提升了测序的准确性、读长和测序通量。

目前，Roche 454 GS FLX Titanium每次运行能产生100万条序列，平均读长能达到400nt，且第400个碱基的准确率能达到99%。一次运行所需时间为10小时，能获得4-6亿个碱基的序列信息。

2. Illumina Solexa测序技术

Illumina公司的第二代测序仪最早由Solexa公司研发，利用其专利核心技术"DNA簇"和"可逆性末端终结（reversible terminator）"，实现自动化样本制备和大规模并行测序。Illumina公司于2007年初花费6亿美金巨资收购了Solexa。2010年初，Illumina将其第二代测序仪Genome Analyzer IIx升级到HiSeq 2000。

HiSeq 2000含有两张Flow cell，可同时运行或者只运行其中一张。读长为100nt，同时支持Fragment、Pair-end和Mate-Paired文库。每次运行最多可产生200 GB的数据量（读长为2x100nt）。

3. ABI SOLiD测序技术

过去20年，美国应用生物系统公司（ABI）在一代测序方面一直占据着垄断地位。第二代测序技术出现以来，ABI公司不甘落后，迅速赶上，于2007年底推出了SOLiD 第二代测序平台。2010年末又发布了最新产品--SOLiD 5500xl测序平台。从SOLiD到如今的SOLiD 5500xl，短短三年时间，连升五级，发展速度惊人。

SOLiD全称为Supported Oligo Ligation Detetion，它的独特之处在于它以四色荧光标记寡核苷酸的连续连接反应为基础，而没有采用传统的边合成边测序技术。连接反应没有DNA聚合酶合成过程中常有的错配问题，而SOLiD特有的"双色球编码技术"又提供了一个纠错机制，这样设计上的优势使得SOLiD在系统准确性上大大领先于其它平台。

目前最新款SOLiD 5500xl含有两张微流体芯片（microfluidic FlowChip），每张芯片含有6条相互独立的运行通道（run lane）。每条lane都能运行相对独立的测序反应，这样的设计使得SOLiD 5500xl测序平台极具灵活性。最大测序读长为75nt，同样支持Fragment、Pair-end和Mate-Paired文库。单次运行能得到的最大数据量为300Gb（使用最新设计的nanobeads）。测序的系统准确性能达到99.99%。
SOLiD测序技术路线：

第二代测序技术的应用

技术推进科学研究的发展。随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行重头测序（de novo sequencing），获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础；对有参考序列的物种，进行全基因组重测序（resequencing），在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础。在转录组水平上进行全转录组测序（whole transcriptome resequencing），从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性（cSNP）等研究；或者进行小分子RNA测序（small RNA sequencing），通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子。在转录组水平上，与染色质免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。

这边需要特别指出的是第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用--目标序列捕获测序技术（Targeted Resequencing）。这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针，这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合，从而富集到特定区段，然后用第二代测序技术对这些区段进行测序。目前提供序列捕获的厂家有Agilent和Nimblegen ，应用最多的是人全外显子组捕获测序。科学家们目前认为外显子组测序比全基因组重测序更有优势，不仅仅是费用较低，更是因为外显子组测序的数据分析计算量较小，与生物学表型结合更为直接。

目前，外显子组测序开始广泛应用于寻找疾病的候选基因上。内梅亨大学的研究人员使用这种方法鉴定出Schinzel-Giedion 综合征中的致病突变，Schinzel-Giedion综合征是一种导致严重的智力缺陷、肿瘤高发以及多种先天性畸形的罕见病。他们使用Agilent SureSelect序列捕获和SOLiD对四位患者的外显子组进行测序，平均覆盖度为43倍，读长为50 nt，每个个体产生了2.7-3 GB可作图的序列数据。他们聚焦于全部四位患者都携带变异体的12个基因，最终将候选基因缩小至1个。而贝勒医学院基因组测序中心也计划对15种以上疾病进行研究，包括脑癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、心脏病、糖尿病、自闭症以及其他遗传疾病，以更好地理解致病突变以及突变对疾病的影响。前不久刚刚结束的Science杂志年度十大科学突破评选中，外显子组测序名列其中。

Cervical Cytologic and Histologic Terms

Cytology

ASC-US
Atypical squamous cells of undetermined significance
ASC-H
Atypical squamous cells–cannot exclude HSIL
LSIL
Low-grade squamous intraepithelial lesion
HSIL
High-grade squamous intraepithelial lesion
AGC
Atypical glandular cells
AIS
Adenocarcinoma in situ

Histology
CIN 1
Cervical intraepithelial neoplasia, grade 1
CIN 2
Cervical intraepithelial neoplasia, grade 2
CIN 3
Cervical intraepithelial neoplasia, grade 3
AIS
Adenocarcinoma in situ

Diagnostic excisional procedure
Obtaining a histologic specimen of the transformation zone and endocervical canal by laser or cold-knife conization or loop electrosurgical excision or conization
Endocervical assessment
Evaluating the endocervical canal for neoplasia by colposcopy or endocervical sampling
Endocervical sampling
Obtaining a cytologic sample with a cytobrush or histologic specimen by a cytobrush or endocervical curette
Endometrial sampling
Obtaining a specimen for histologic evaluation by endometrial biopsy, dilatation and curettage, or hysteroscopy

子宫恶性肿瘤诊治进展1：宫颈癌 (转发)

本文发表于《国际妇产科学杂志》

林仲秋 卢淮武

子宫是孕育胚胎、胎儿和产生月经的器官。同时，子宫也是容易发生恶性肿瘤的器官。从子宫颈到子宫体，子宫内膜到子宫肌层，各部位均可发生恶性肿瘤。宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，高危型乳头瘤病毒（HPV）的持续性感染是引起宫颈癌前病变和宫颈癌的基本原因。主要病理类型为鳞状细胞癌和腺癌，确诊依赖于宫颈病灶的活体组织病理检查，对病变程度的判断采用FIGO的临床分期。宫颈癌治疗早期以手术为主，中晚期以放疗为主，辅以化疗的综合治疗，近年来靶向治疗为局部晚期、复发性、转移性宫颈癌提供新的治疗途径。HPV疫苗已开始应用于宫颈癌的预防。

宫 颈 癌

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。近40年由于宫颈细胞学筛查的普遍应用，使宫颈癌和癌前病变得以早期发现和治疗，宫颈癌的发病率和死亡率已明显下降。近年来宫颈癌发病有年轻化的趋势。目前认为人乳头瘤病毒感染（HPV），特别是高危型的持续性感染是引起宫颈癌前病变和宫颈癌的主要原因，其他相关影响因素有早年分娩、多产、高危男性伴侣以及机免疫功能抑制等。

1. 宫颈癌的筛查和诊断

1.1 三阶梯式诊断技术

宫颈癌是宫颈上皮内瘤变（CIN）经过长时间发展而成的，因此早期发现和及时阻断宫颈癌癌前病变是降低宫颈癌发病的有效手段。三阶梯式诊断技术是全世界范围内专门用于筛查诊治宫颈癌及其癌前病变的常规诊断技术，包括宫颈细胞学检查、阴道镜检查和宫颈病理学检查。

1996年美国食品和药物管理局（FDA）批准了改善的制片技术—薄层液基细胞学技术，以期改善由于传统巴氏涂片上存在着大量的红细胞、白细胞、黏液及脱落坏死组织等造成的50%～60%的假阴性。目前有Thinprep和AutoCyte Prep两种方法。可将识别宫颈高度病变的灵敏度和特异性提高至85%～90%左右。目前国内外绝大多数采用TBS分类法对宫颈细胞学进行评价与报告。

液基薄层细胞学检查是宫颈病变的初筛手段，阴道镜通过对宫颈、阴道、外阴等病变部位放大及醋酸试验后观察宫颈表面的上皮和血管形态，初步判断病变的性质，并对严重的病变处取活检，对早期发现宫颈癌及癌前病变有重要的价值。经宫颈细胞学检查与阴道镜评估，以宫颈多点活检或宫颈锥切做出组织病理学诊断为三阶梯诊断技术中的“金标准”。

TBS报告中与鳞状上皮异常相关的描述性诊断包括：不典型鳞状细胞（ASC），低度鳞状上皮内病变（LSIL），高度鳞状上皮内病变（HISL），鳞状细胞癌（SCC），不典型腺上皮（AGC），不典型腺上皮倾向瘤变（AGC favor neoplasia），原位腺癌（AIS），腺癌（ACA）。以上异常细胞学结果均提示需要进行下一步的检查。TBS报告系统中还有一个重要概念—不明确意义的不典型鳞状上皮细胞（ASCUS），既不能诊断为感染、炎症、反应性改变，也不能诊断为癌前病变和恶变的鳞状上皮细胞，可作为阴道镜检查的最低指征，也可以在液基细胞学的基础上检测高危型HPV-DNA。

1.2 HPV检测

多数HPV感染是一过性的，只有持续的HPV感染才会导致宫颈癌的发生，根据病毒致病力大小，分为低危型和高危型两大类。低危型HPV，如HPV6，11，42，43，44等，主要引起外生殖器湿疣等；目前发现的15种高危型HPV致瘤病毒，如HPV16，18，31，33，35等， 主要引起宫颈癌、外阴癌等恶性肿瘤，其中HPV16，18是引起宫颈癌最常见的两种亚型，HPV16与宫颈鳞癌关系密切，HPV18易导致宫颈腺癌。

2005年世界卫生组织（WHO）发表声明称：有充足的证据表明HPV-DNA检测可作为子宫颈癌的初筛手段，并可以降低子宫颈癌的发病率和死亡率。综合近年来的一些研究，对于临床上检测HPV-DNA 的作用有以下几方面的认识：①对不明确意义的非典型鳞状上皮细胞/腺细胞（ASCUS/AGUS）作进一步的判断，是一种有效的再分类方法，能将宫颈上皮内瘤变从细胞学结果为ASCUS/AGUS 中有效地检出，减少了阴道镜下活检明确宫颈癌前病变的患者的数量。②根据感染的HPV类型预测受检者的发病风险度，决定其筛查间隔。对于细胞学阴性而高危型HPV阳性者，发病风险度较高，此类人群要定期随访；两者均阴性者，发病风险较低，可适当延长其筛查间隔。③宫颈癌前病变和癌症治疗后的监测。术前HPV负荷量高，术后HPV仍持续感染，尤其是16/18型，是宫颈癌前病变和宫颈癌复发的高危因素。因此，HPV检测对于术后随访具有重要意义。

用HPV检测筛查宫颈癌时应因人群而异。年轻妇女性生活频繁，病毒感染率高，但通常为一过性，故HPV-DNA 检测的效果在较高年龄（＞30岁）的女性最佳。目前HPV 检测的成本－效益分析及其能否成为更合理的筛查手段来最终降低宫颈癌发病率和死亡率的研究，还需开展更多的工作。

1.3 宫颈癌 FIGO 2009 新临床分期

国际妇产科联盟（FIGO）2009年更新的临床分期，主要有两个改动：①取消了0期。②ⅡA期细分为ⅡA1 肿瘤直径≤4.0 cm和ⅡA2肿瘤直径＞4.0 cm。

1.4 影像学检查在宫颈癌中的应用

1.4.1 核磁共振（MRI）MRI由于具有高组织分辨力和多方位、多序列成像等特点，在宫颈癌的诊断、分期、治疗计划的制定和疗效评价方面起着重要的作用。MRI明显优于超声及CT 检查， 可作为宫颈癌临床分期的辅助方法。MRI矢状面既能显示子宫颈、子宫体全貌，又可明确其与阴道、膀胱的位置关系，可很好显示宫颈癌是否侵犯阴道、宫体，在判断膀胱及直肠是否受侵方面也具有较大价值；横断面利于显示宫旁组织，利于观察肿瘤向宫颈部及宫旁、邻近器官、盆壁的侵犯情况，以及盆腔淋巴转移情况；冠状面则利于显示子宫颈、子宫侧壁及阴道穹隆，可直接显示肿瘤及肿瘤与周围组织间关系，显示病灶确切的大小和位置。横断位及矢状位T2W TSE是宫颈癌诊断的最重要的扫描序列，且结果可靠。

1.4.2 PET-CT PET全称为正电子发射计算机断层显像（position emission tomography，PET），是反映病变的基因、分子、代谢及功能状态的设备。其是利用正电子核素标记葡萄糖等人体代谢物作为显像剂，通过对病灶对显像剂的摄取来反映其代谢变化，从而为临床提供疾病的生物代谢信息。CT（Computed Tomography）是X线断层显像技术。可以清楚的获得病变的解剖结构信息。当时紧靠结构特点诊断疾病又局限性，有些病变的性质比如肿瘤的良恶性、手术后肿瘤有无复发均难以做出准确的判断，不能准确的反映疾病的生理代谢状态。

PET-CT是将PET与螺旋CT的精细结构显像两种显像技术融于一体，可以同时获得CT解剖图像和PET的功能代谢图像，两种图像优势互补，是医生在了解生物代谢信息的同时获得精准的解剖定位，从而对疾病做出全面、准确的判断。PET-CT可以发现小至3 mm的早期肿瘤。

2012年美国国立综合癌症网络（NCCN）宫颈癌指南指出要重视影像学检查特别是PET-CT在治疗前评估的作用，在美国，IB1期以上患者在治疗前几乎常规都做PET-CT检查。但在国内，由于其检查费用十分昂贵，PET-CT并未成为宫颈癌的常规检查，主要应用于晚期以及复发性疾病的评价。

2 宫颈癌的治疗

根据临床分期、患者年龄、生育要求、全身情况、医疗技术水平及设备条件等综合考虑制定适当的个体化治疗方案。采用以手术和放疗为主，化疗为辅的综合治疗方案。

2.1 手术治疗

2.1.1 早期宫颈癌的手术方式 根据Piver Rutledge手术分型，早期宫颈癌手术类型可分为以下3大类，即：①Ⅰ 型筋膜外子宫切除术（Extrafascial Hysterectomy）。②II 型子宫切除术或次广泛子宫切除术（Modified Radical Hysterectomy，即Wertheim’手术）。③III型子宫切除术或广泛子宫切除术（Radical Hysterectomy，即Meigs’手术）。手术主要适应于IIa期以前的宫颈癌患者。手术途径包括经腹、经阴道和腹腔镜等途径。

2.1.2 保留生育功能的手术：宫颈广泛切除术 宫颈广泛切除术保留子宫体，广泛切除宫颈及宫颈旁组织及上1/3阴道，切除80%宫颈，吻合残余宫颈间质与阴道黏膜边缘。现有资料表明宫颈广泛切除术是保留生育能力的可行术式，但是仍缺乏循征医学一级证据，目前还不是标准的治疗方法。

手术途径经阴道者术中先用腹腔镜进行盆腔淋巴切除，然后经阴道行广泛宫颈切除。开腹者则盆腔淋巴切除和广泛宫颈切除均经腹部完成。也有在腹腔镜下完成全部手术步骤的。

术前应该对所有的患者进行仔细的临床检查，应用触诊、视诊、阴道镜、宫颈内膜诊刮、CT、MRI等检查进行准确的临床分期。除了严格掌握手术适应症之外，还需同时满足以下条件方可进行该手术：①要求保留生育能力。②无不育临床证据，年龄<40岁。一般认为适应症为Ⅰa期并有脉管浸润，Ia2~Ib1期肿瘤直径<2 cm。③无宫颈管内膜侵犯。④CT，MRI检查无淋巴结转移证据。⑤向患者充分解释手术方式及预后，签署知情同意书。

宫颈广泛切除术后可能出现一些并发症，如不孕、宫颈粘连、宫腔积血导致周期性下腹痛、流产或早产；如果20周后出现死胎，需剖宫取胎等许多问题，这些问题需要和患者和家属充分沟通，同意承担风险。宫颈广泛切除术用于腺癌资料有限，但并非禁忌症。

2.1.3　复发性宫颈癌手术：盆腔廓清术 全盆腔廓清术的手术指征是放疗或手术联合放疗后出现了中心性复发而未发现远处转移的患者。术中需要整块将膀胱、子宫、直肠、阴道切除，有时甚至需要切除部分外阴组织，制定手术范围时需要根据患者复发的范围和病灶位置。该术式可分为前盆腔廓清术和后盆腔廓清术，前者需要切除患者的膀胱，后者则需要切除直肠。在对宫颈癌中心性复发进行治疗时，全盆腔廓清术是最常用的术式。据报道，术后患者的5年生存率为40%，不同报道中5年生存率介于18%～70%之间。虽然目前可使用放化疗对Ⅳ A期宫颈癌进行治疗，全盆腔廓清术已很少使用，但是仍有学者选择该术式。

重建术是全盆腔廓清术的一部分，在该过程中需要对尿道进行再造，可选择肠管（回肠、横结肠和乙状结肠）作为管腔对尿液进行引流，在阴道和盆腔重建的过程中，可使用肌肉皮瓣（腹直肌或股薄肌）、结肠（极少使用）或网膜。根据肿瘤位置的切除范围，可在肛提肌平面以上对直肠和结肠进行吻合，或行永久性结肠造瘘。

盆腔腔廓清术是一种创伤极大的手术方式，只可用于局部复发的患者。盆壁侵犯、远处转移、肾积水是全盆腔廓清术的禁忌症。尽管术前进行充分的评估，仍有25%～50%的患者在接受该手术的过程中因发现肿瘤转移和局部晚期病变而无法完成手术。术前很重要的一方面是要对患者的身体状况、心理状态和社会状态进行充分评估，告知患者接受该种手术后会出现哪些结果是非常必要的，必须使患者意识到手术的后果。围手术期并发症包括出血、感染、心肺并发症、胃肠瘘、尿瘘、瘘形成、肠梗阻和皮瓣坏死。性功能障碍和社会心理障碍是术后的远期并发症，这些并发症可能长期持续存在。即使对患者进行充分选择后，手术死亡率仍可达到5%。

2.2 放射治疗

1898年Wertheim行施了子宫广泛切除+盆腔淋巴清扫术治疗宫颈癌。同年Curie夫妇发现镭并很快用于宫颈癌的治疗。由于镭疗效果良好，使手术一度停滞。很多妇科医师将宫颈癌的治疗转向放疗，又促进了放疗的发展。20世纪20年代体外照射又用于宫颈癌治疗，进一步提高了疗效。

2.2.1 放疗技术的种类 ①常规放疗（Conventional Radiotherapy）：传统的定位、治疗方法，予常规/接近常规分割剂量，二维思维和计算对照射靶区进行剂量预测的传统放疗模式。常规放疗尚有约30% 的患者得不到根治，另有约20%～30%患者出现放疗后并发症，其中放射性直肠炎约10%～20%，放射性膀胱炎约3%～5%。②精确放疗（Precision Radiotherapy）：包括立体定向放射治疗（Stereotactic Radiotherapy，SRT）和适型调强放疗（Intensity modulated Radiotherapy IMRT）。适型调强放疗属于精确放疗范畴，是集临床放疗学、医学影像图像处理技术、计算技术、加速器工程技术等为一体的治疗手段， 是放疗技术进步的里程碑之一。传统放疗的主要缺点是不能把放射线局限在肿瘤区内，照射增益比较低，单次照射剂量不高，对肿瘤局部控制能力差。在有些情况下，肿瘤靶区本身包含敏感的正常组织，采用传统放疗难以进行治疗。通过调整多个照射野内的强度分布， 得到高度适形的靶区三维剂量分布，从而可在不增加甚至减少周围正常组织受照剂量前提下，达到增加靶区剂量，提高治疗增益比的目的。

2.2.2 放疗的方法 ①术前放疗目的是缩小局部肿瘤，减低癌瘤的活力，避免手术时肿瘤扩散以及减少局部复发的机会。主要采用腔内放疗，适应于：宫颈较大的外生型肿瘤；IIa期阴道侵犯较多；黏液腺癌，鳞腺癌，透明细胞癌；病理分级II级以上，剂量给予腔内放疗全量的1/3～1/2。于放疗完成后4～6周内手术。②术中放疗（Intraoperative Radiation Therapy，IORT）：虽然术中放疗在国外开展较早，但在中国却刚刚起步。该技术通常采用电子射线或高剂量放疗（HDR）近距离放疗，主要用于术前对化放疗反应差的原发性晚期或复发性宫颈癌，但不适用于已出现远处转移的患者（腹主动脉旁淋巴结转移并不是绝对禁忌证）。术中放疗的特点是可直接对肿瘤切除后容易复发的危险部位进行一次大剂量（10～25 Gy）照射，而周围的正常组织或器官可最大限度被排除或遮挡在照射野外，对提高手术的切除率和局控率有帮助。③术后放疗补充手术不足，主要采用腔内近距离放疗，适用于没有淋巴结转移但合并有以下高危因素如原发肿瘤体积较大、有深层间质浸润和/或淋巴脉管间隙浸润者。淋巴结阳性和/或切缘阳性和/或宫旁浸润者需补充盆腔放疗；由于手术造成解剖的变异及组织黏连给术后放疗增加了困难，放疗前应进行消化道造影，以了解肿瘤与周围器官尤其是和肠道的关系，以便选择最适宜的治疗方案。可于手术后2周进行。④根治性放疗适应于IIb期以上患者的治疗。

2.3化疗

2.3.1 化疗的适应证 ①晚期、全身广泛转移病例。②局部巨大肿瘤的术前化疗。③中晚期宫颈癌配合放疗增敏。④具有高危因素宫颈癌术后辅助性化疗，这些高危因素包括：腹膜后淋巴结转移；低分化且肿瘤直径≥2 cm；脉管受累；术后病理检查发现肿瘤直径﹥4 cm。⑤组织病理类型恶性高度者：透明细胞癌、小细胞癌、未分化癌等。

2.3.2化疗方案 包括卡铂+紫杉醇、顺铂+紫杉醇、顺铂+托泊替康、顺铂+吉西他滨；可供选择的一线单药有顺铂（首选）、卡铂、紫杉醇。推荐的二线治疗药物有贝伐单抗、多烯紫杉醇、5-Fu、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、丝裂霉素、拓扑替康、培美曲塞、长春瑞滨。

2.4靶向治疗

传统的治疗方法在某些病例尤其是局部晚期、转移性和复发性宫颈癌患者并未取得令人满意的疗效，因而，越来越多的研究集中于宫颈癌的靶向性治疗，分子靶向治疗已经成为未来的发展趋势。目前研究的靶向治疗药物有以下几种：

2.4.1 表皮生长因子受体拮抗剂（EGFR） EGFR亦称HER-1，是酪氨酸激酶生长因子受体家族的成员之一，属于I型酪氨酸激酶受体亚族（ErbB 1～4），具有酪氨酸激酶活性，EGFR在包括宫颈癌在内的多种人类实体肿瘤组织中均有过表达，EGFR通过介导多条细胞內信号转导途径，调节正常细胞的生长和分化，增强肿瘤细胞侵袭力、促进血管生成、抑制肿瘤细胞凋亡，使其成为肿瘤诊断和治疗的新靶点。目前靶向EGFR 的肿瘤治疗药物主要分为两类：EGFR单克隆抗体和小分子化合物酪氨酸激酶拮抗剂，其中单克隆抗体主要包括：曲妥珠单抗[Trastuzumab（赫赛汀，Herceptin）]、西妥昔单抗[Cetuximab（IMC-C225，埃比特斯）]等；小分子化合物主要包括吉非替尼[ Gefitinib（易瑞沙，Iressa，ZD1839）]、伊马替尼[ Imatinib（格列卫，Glivec，ST I51）]和埃洛替尼[Erlotinib（Tarceva，OSI-774）] 等。

2.4.2 血管内皮生长因子（VEGF） VEGF是一种多功能细胞因子，由不同肿瘤细胞分泌，也可在发育中的正常细胞及组织中表达。是一种有效的血管通透性诱导因子和胱氨酸生长因子超家族的一员，在肿瘤血管生成中起关键作用，其结构和生物学特征对肿瘤发生、肿瘤转移及预后具有重要意义，是重要的血管生成抑制治疗靶向。有以下几种；

α干扰素（INF-α）：INF-α是一种细胞因子，是机体感染病毒时，宿主细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能相近的低分子糖蛋白。INF-α能够显著抑制TNF-α诱导宫颈癌HeLa 细胞核因子ｋB（NF-ｋB） 的表达，增强T NF-α诱导HeLa 细胞凋亡的作用。利用重组IFN-α治疗宫颈恶性肿瘤，可直接抑制宫颈癌细胞的生长，并可能通过抑制HPV-16 E6、E7基因表达的分子机制，达到抑制肿瘤的目的，可作为宫颈癌放疗的增敏剂，该领域的研究仍需要更多的临床随机对照试验证实。

唑来膦酸（ZA）：基质金属蛋白酶-9（MMP-9）是一种肿瘤浸润巨噬细胞分泌的促血管生成蛋白酶，功能涉及VEGF 的活化，伴随血管生成机制的启动出现于细胞外间质中，临床前期试验通过典型MMP抑制剂及其二磷酸盐化合物唑来膦酸靶向MMP-9及新生血管形成， 典型MMP抑制剂及ZA 均可关闭血管生成开关，抑制癌前病变进展并抑制肿瘤生长，这种作用与MM P-9的基因敲除具有等效性，ZA增加了肿瘤上皮和内皮细胞凋亡，但对增殖作用无影响，提示ZA不具备抗有丝分裂活性。关于ZA 可能的细胞和分子作用机制为：ZA通过抑制肿瘤浸润巨噬细胞MMP-9的表达并抑制MMP-9的活性，减少VEGF及其受体相关的肿瘤血管内皮细胞生成，鉴于发现其在临床应用中具有较小的毒性反应，因此可以作为靶向MMP-9的抗血管生成药物。

贝伐单抗（Bevacizumab，Avastin，rhuMAb-VEGF）：是一种人源化单克隆抗体IgG1， 通过抑制VEGF 生物活性抑制血管生成，贝伐单抗单药治疗或与其他化疗药物联合应用均可减少肿瘤血管生成。

舒尼替尼（Sunitinib）：Sunitinib是一种口服的多靶点酪氨酸激酶抑制剂， 能够抑制VEGF-R2、-R3 和-R1及血小板衍生生长因子（PDGFR-b）、KIT、FLT-3 和RET 的酪氨酸激酶活性，通过特异性阻断这些信号传导途径达到抗肿瘤效应， 美国FDA 最近批准Sunitinib 用于治疗胃肠道间质瘤和晚期肾癌的治疗。

2.4.3内皮素轴（ET axis） ET轴由内皮素ET-1、ET-2、ET-3及其受体ET（A）R和ET（B）R组成，于多种细胞及组织中均有表达，前内皮素（big-ET-1）经过内皮素转换酶（endothelin－converting enzyme，ECE）的作用形成具有生物活性的ET- 1，ET-1在包括组织发生、细胞增殖、凋亡及血管发生等生理学及病生理学进程中均发挥重要的作用，通过ET（A）R的介导，活化的ET（B）R预防凋亡、抑制ECE 的表达并调控ET-1在组织细胞内的清除，已有资料证实内皮素轴于包括卵巢癌在内的多种妇科恶性肿瘤的发生和进展密切相关，在子宫颈癌组织中ET- 1活化ET（A）R后引起细胞内信号传导通路的激活是肿瘤发生和进展的关键机制，更深入的研究集中于选择性内皮素受体A 拮抗（selective ET（A）Rantagonists）和内皮素转换酶抑制剂（ inhibitors of the　ECE）。

3 宫颈癌的预防

　　2006年6月，美国FDA正式批准HPV疫苗上市，用于宫颈癌的预防，这是世界上第一个肿瘤疫苗，是人类抗癌斗争的里程碑。2008年该疫苗已在全球100多个国家获准投入使用。目前投入使用的HPV疫苗均需多次注射（3次），而且价格较昂贵。FDA批准的2种HPV疫苗在中国尚未获得批准，国产HPV疫苗的研制工作正在进行中。由于HPV感染与外阴癌、阴茎癌、肛门癌等20余种肿瘤之间存在关系，HPV疫苗也在努力扩展其适应证。

疫苗包括预防性疫苗和治疗性疫苗。现在投入使用的都是预防性疫苗。FDA将HPV疫苗归类为B类药物，但不推荐女性在妊娠期使用。预防性疫苗需要10～20年方能确切显现效果。由于HPV疫苗使用时间还不到10年，远期效果尚待证实。

终于搞定了，各种各样麻烦的性能评价实验！和各种各样复杂啰嗦的资料！今年一半的任务完成了！！！


部分市场上已有的荧光PCR盒子和膜杂交盒子

5. 感染监测
5.1 宫颈感染
2003年3月，美国FDA批准Qiagen的HPV HC2 DNA Test，一种杂交-捕获检测试剂，作为检测HPV宫颈感染的初步筛查方法，Pap检测的附属物，可以在常规Pap涂片过程中进行。HC2可以检测最常见的ingxiang宫颈的18种HPV型别，并区分高危和低危型别，但无法检测特殊的HPV型别。
国立癌症研究所声明：“宫颈细胞测试样品是鉴别HPV高危型别存在的有效方式。FDA已经批准了一种HPV测试作为女性Pap检测结果模糊的跟进方法，和30岁以上妇女及广泛宫颈癌筛查的方法。这种方法至少可以鉴别和宫颈癌进程相关的13种HPV高危型别。并可以在宫颈细胞发生决定性的明显变化前发现高危型HPV。”
近期宫颈癌分子鉴定方法研究成果提供了在细胞涂片和组织学、细胞学样本中监视分子质变的特异生物标记和癌标志物有效信息。这些生物标记和癌标志物可能有助于改善用于初筛和级别分类的同高危进程相关的损伤检测方法。E6和E7 mRNA 检测方法 Pre Tect HPV-Proofer（HPV Onco Tect），或p16 细胞周期蛋白水平都是新分子标记的例子。依据发表的结果，这些高灵敏、高特异的标记可用于鉴定细胞恶性化过程。
5.2 其它检测
尽管已经可以在男性中检测HPV DNA，但因为检测无结论性结果和医学上的必要性，目前还没有美国FDA认可的用于广泛筛查的方法，或加拿大政府认可的检测方法。
生殖器疣是低危HPV在男性中的唯一明显标志，可通过生殖区目检鉴定，这些可视的生长物是非致癌性HPV型别的结果。5%醋酸可以使异常组织发白被用于鉴别疣和鳞状上皮损伤（SIL），但检测成功率有限，多数医生发现这项技术仅在湿润区有用，如女性生殖区。
6. 治疗
目前仍没有HPV感染的治疗方法。病毒感染通常是靠自身清除。专家无法就病毒是被完全清楚还是数量减少到检测水平一下达成统一意见，也很难搞清楚一个人是否处于传染期。
7. 最新研究
7.1 Microbicide（杀微生物剂，杀菌剂）
一些正在进行的研究提出若干廉价的化学品如果在性接触前用于生殖器可以用于阻断HPV传播。2006年的一项研究表明一些使用角叉藻聚糖胶凝剂的性润滑剂可以在体外抑制HPV感染。而证明角叉藻聚糖胶凝剂在体内也有效的临床实验正在进行中。
7.2 HPV-16 exists in bacteria
传染性微生物和HPV-16的持续感染存在联系。宫颈癌活组织检查14个中有12个菌株（经部分16SrDNA鉴定为肠球菌、葡萄球菌、杆菌和棒状杆菌）为HPV-16阳性。上诉四种菌种的总DNA被分离后，使用PCR和Southern杂交检测到HPV-16基因和基因组。使用RT-PCR方法在细菌总RNA中检测到HPV-16的E6和L1基因转录物，使用Western杂交和免疫胶体金电镜技术在细菌细胞中检测到HPV-16的L1蛋白表达。透射电子显微镜技术证实细菌细胞中存在病毒颗粒。这些支持细菌携带HPV-16的结果为传染性微生物能促进HPV-16感染到宫颈癌的进程提供了一个可能的解释
8. 流行病学
8.1 表皮HPVs
表皮HPV感染普遍存在，一些型别，如HPV-5的感染可持续一生却不出现任何症状。就像是搭鲨鱼便车而无害的印鱼，这些HPV型别被认为是人的共生物；其它型别如HPV1和2型会可能发感染个体的普通疣。皮肤疣在儿童期非常普遍，发生后在几星期或月余时间自行消退。10%的成年人患有复发性皮肤疣。所有HPVs都被认为有长期潜伏感染少数皮肤干细胞的能力，尽管在免疫控制下不会显现症状但潜伏的HPV可能永远无法全面根除。而免疫功能的型别特异性意味着对一种型别HPV免疫的个体对其它HPV型别依然具有易感性。
8.2 生殖器HPVs
生殖HPV发病率的大幅度增加发生在个体进入性活动的年龄段。大部分生殖HPV不会有明显症状并在几个月左右时间被免疫系统清除掉；而表皮HPV，免疫活性则是和型别有关的；还有一些感染者在免疫控制下不会携带生殖HPV。高危型HPV，如HPV 16、18、31、45等型别的持续感染，可能最终导致宫颈癌或其它癌症。
8.3 产期传播
尽管生殖HPV有时会随着出生由母亲传染给孩子，但是HPV相关疾病却很少出现在新生儿身上。HPV-6和11型的产期感染可能引发幼年发病的复发性呼吸器官乳头瘤病（juvenile-onset recurrent respiratory papillomatosis ，JORRP)。JORRP很罕见，在美国100,000儿童中约有2例发病。如果女性在分娩期患有生殖器疣，JORRP会有非常大的升高，但患病风险仍低于1%。
9. 贫困地区的DNA检测
很多贫困地区无法提供常规筛查。一项宫颈癌研究筛查了印度农村131,746名妇女，发现在8年时间里，单独的DNA检测降低了早期宫颈癌患病和死亡数目，而单独的醋酸检测和巴氏则不能。然而DNA检测费用为30-40美元，很多地区无法支付，并且耗时，需要实验室基础支持。
10. 病毒和癌症相关的发现史
娼妓的宫颈癌患病率远远高于修女这一关键观察结果引导了研究者对性传播HPVs和宫颈癌相关性的推测。德国癌症研究中心的Harald zur Hausen 博士因发现HPVs导致宫颈癌获得2008年诺贝尔生理学和医学奖。